细胞培养实验室
修改时间：2023年8月22日
细胞培养实验室概念
CELL CULTURE LABORATORY CONCEPT
细胞培养又称细胞克隆技术，细胞培养是指在人工创造的与体内环境相似的条件下（比如适宜的温度、pH，以及一定的营养），使细胞生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种技术。
细胞培养方案
细胞培养实验室
修改时间：2023年10月25日
WORKSHOP CONCEPT
细胞培养又称细胞克隆技术，细胞培养是指在人工创造的与体内环境相似的条件下（比如适宜的温度、pH，以及一定的营养），使细胞生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种技术。
组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作:无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储存。
细胞培养方案
CELL CULTURE PROTOCOL
实验室建筑规划
根据细胞种类的不同细胞培养分为原代培养和传代培养。根据细胞生长特点的不同又可分为贴壁培养和悬浮培养。
01
传代培养
细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。
02
原代培养
取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
03
贴壁培养
必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞。
04
悬浮培养
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。多为各种造血系统肿瘤细胞。
细胞生长过程
细胞生产过程分为：游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期（平台期）。
01
游离期
细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形（10min-5h）。
02
贴壁期
细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在10min－5h内贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。
03
潜伏期
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24h。
04
停止期（平台期）
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。
实验室设计要点
KEY POINTS OF PLANNING
CELL CULTURE PROTOCOL
实验室建筑规划
根据细胞种类的不同细胞培养分为原代培养和传代培养。根据细胞生长特点的不同又可分为贴壁培养和悬浮培养。
01
传代培养
细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。
02
原代培养
取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
03
贴壁培养
必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞。
04
悬浮培养
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。多为各种造血系统肿瘤细胞。
细胞生长过程
细胞生产过程分为：游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期（平台期）。
01
游离期
细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形（10min-5h）。
02
贴壁期
细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在10min－5h内贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。高级培养瓶多涂有生长基质以帮助细胞贴附。
03
潜伏期
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24h。
04
对数生长期
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
04
停止期（平台期）
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。
实验准备和步骤
PREPARATION AND STEPS
一、细胞间仪器 | |
|---|---|
01 生物安全柜 | 生物安全柜是一种负压的净化工作台，正确操作生物安全柜，保持无菌 环境的同时能够完全保护工作人员、受试样品并 防止交叉污染的发生。 |
02 培养箱 | 一般培养条件为：温度：37℃，湿度：10%，CO2浓度：5%~10%。 |
03 水浴锅 | 温度波动较大会对细胞的正常生长造成
影响，尤其当细胞的生长状态尚不 稳定或对外界刺激较敏感时（复苏、处理因素作用后等）。同时，低温可 能还会干扰 某些处理因素的作用，比如某些酶的作用，药物的溶解等。 |
04 低速离心机 | 用来收集细胞。 |
05 冰箱 | 存放培养基，药物等试剂。 |
06 倒置显微镜 | 观察细胞生长状态和生长密度。 |
07 移液器、电动移液器 | 添加培养基体积较大时，电动移液器更方便，快捷。 |
08 细胞冻存盒 | 程序性细胞冻存盒，冻存细胞遵循的是"慢冻"原则，主要是防止细胞在冻存过程中形成冰晶而对细胞造成损害。 |
二、实验步骤 | ||
|---|---|---|
首言 | 第一次开始培养某种细胞时，一定要查清楚关于该种细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂，通常的消化时间、传 代时间等。实验前，至少提前30min打开操作台紫外灯和37℃水浴锅，将PBS、胰酶、培养基等试剂提前10min预热。 | |
01 细胞 复苏 | （1）提前配置培养基：10% FBS+1% P/S+完全培养基（以下称10%培养基）； | |
（2）将细胞冻存管从液氮中取出后，立即放在37℃水浴锅中摇晃。时刻关注，冻存管内完全融化后，低速离心机常温1000r/min，离 心5min（缓冻速融）； | ||
（3）离心后，立刻用移液枪吸出上层液体，再吸取1ml 10%培养基，将细胞团块重悬，轻轻吹打5~8次即可，观察液体无明显白色团块 后将重悬液加入T25细胞培养瓶，再向培养瓶中补5~6ml 10%培养基，摇晃均匀，将培养瓶放在37℃，5% CO2细胞培养箱中，12、24 h后观察细胞生长情况。 | ||
02 细胞 传代 | （1）观察细胞生长情况和生长密度，在倒置显微镜下观察，当细胞密度在80% ~90%之间，可以传代。若培养基变黄（未污染的话）， 但细胞密度较低，将培养基弃掉，2~3mL PBS润洗1~2次后，加入10% 培养基，继续培养，不进行传代。 | |
（2）弃去细胞瓶内培养基，加2~3mL PBS润洗细胞1~2次，用移液枪将PBS完全吸干净，防止影响胰酶消化。 | ||
（3）加2~3mL 0.25% 胰酶消化1~10min（不同细胞贴壁程度不同，消化时间不同），主要分为湿法消化和干法消化。 | ||
（4）当细胞成片脱落时，立刻加入4~6mL 10% 培养基停止消化，防止消化过度。吹打动作轻柔，吹打至3、5个细胞连成团即可（消化 为主，吹打为辅）。将细胞悬液加入离心管，常温，1000rpm/min，离心3~5min（根据实际情况，这步可以省略）。 | ||
（5）细胞团块用10% 培养基重悬，补10%培养基到一定体积（T25：5~6mL; T75：15mL），传代完毕。记录传代次数，传代比例一般 为1：2或1：3，两次传代之间至少间隔24~48h。 | ||
平面布局示意图
LAYOUT OF THE LAB
平面布局示意图
PCR LAB LAYOUT
